neubauer计数板

实验
目的原理 了解血细胞计数的原理并掌握红细胞、白细胞、血小板计数的方法,红细胞计数结果结合血红蛋白值还可以计算出红细胞平均血红蛋白量(MCH)可作为生理机能检查和临床诊断的指标。用相应的稀释液将血液稀释若干倍(另有抗凝、固定、着色作用),置于计数室中,在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。 稀释血液有血细胞吸管法和试管法,本实验采用后者。

实验对象与用品 鸡或家兔。血细胞计数板、专用盖玻片、吸血管、显微镜、手揿计数机、血细胞稀释液、拭镜纸、毛笔。

方法步骤

(一)熟悉计数室

血细胞计数板系一长方形厚玻片,常用的改良牛氏(Improved-Neubauer) 计数板在中央横沟的两边各有一计数室,两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此,放上盖玻片时,计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成9个边长为1毫米方格。四角的大方格又各分为16个中方格,这是用来计数白细胞的。中央大方格被划分为25个中方格,每一中方格又划分成16个小方格(图8-2称25×16,也有的计数板为16×25的,小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心5个中方格(16×25者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。

(二)红细胞计数

先用试管稀释法制备禽类血细胞悬液:将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到41~42℃,取Ⅰ液1mL于试管中,用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)20霯,再加入Ⅱ液1mL混匀,置该水浴锅中保温50s左右,置室温,即为待检的血细胞悬液。可用于充液计数。取干洁的计数板,置于水平的显微镜载物台上,盖上盖玻片,使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液,用滴管吸取,将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外,让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内,刚好充满计数室为宜(图8-3)。静置2min后计数,先用低倍镜观察,不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度,认清 计数室位置。采用“由上至下,由左至右,顺序如弓”的顺序,对压边线细胞采取“数上不数下,数左不数右”的原则(图8~4)。依次计数并记录5个中方格中分别有多少个红细胞。

(三)血小板计数

采取血液并立即与抗凝剂混合(由于血小板具有趋向于凝集和粘附于异物表面的特性)。以血小板稀释液(10%EDTANa2 10mL与0.8%NaCl90mL组成)将血液稀释200倍,混匀后滴入血细胞计数室内,静置15min,待血小板下沉后。于高倍镜下计数(同红细胞 计数)。在高倍镜下血小板呈椭圆形、圆形或不规则的折光小体分布于红细胞间,注意与杂质相区别。也可用复方尿素稀释液稀释血液,应静置20min以上,待红细胞充分溶解后再充液计数。
(四)计算

按计数室构造及血液稀释倍数,将血细胞计数结果换算成每立方毫米中血细胞的个数。以每100mL血液中的血红蛋白量(g)乘以10再除以红细胞数(106/mm3)得红细胞平均血红蛋白量(MCN,单位μμg)。

(五)仪器洗涤

计数板、盖玻片和测定管用清水冲洗,再用绸布或细布沾干。

要求与思考题

1.计算结果,报告中简要说明计算过程。求出本组同学测定的均值并评价之。

2.了解各类稀释液成分,分析各物质的作用。

注意事项

1.充液前应充分混匀血细胞悬液,充液要连续、适量,充液后应待血细胞下沉后再计

数。

2.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。

组织建议 将相同类型的计数板集中在一个组内,便于指导。本实验属于基本操作,各位朋友均应独立操作得出结果。

附注:

1.本法可同时计数禽类白细胞数,计算方法也类似。

2.禽类血细胞稀释液为:

Ⅰ液

中性红 25.0mg

NaCl 0.9g

加蒸馏水至100.0mL
Ⅱ液

结晶紫 12.0mg

柠檬酸钠 3.8g

福尔马林 0.8mL

加蒸馏水至100.0mL

3.哺乳类红细胞稀释液可用生理盐水或阿扬(Hayem)氏液(NaCl 1g,Na2SO4·10H2O 5g,HgCl2 0.5,加蒸馏水至200mL过滤)。白细胞稀释液成分为冰醋酸0.1mL,1%龙胆紫1mL加蒸馏水至100mL,或直接用2%醋酸溶液。

4.血小板复方尿素稀释液配方为:尿素10g,柠檬酸钠0.5g,甲醛0.1mL,加蒸馏水到100mL,混合,待完全溶解后过滤。置冰箱内可保存1~2周。我用的全自动自动分析仪赞同一楼朋友的意见!
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